Les techniques d'étude : le caryotype

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1)    Comment visualiser la chromatine ?

2)    Obtention de préparations chromosomiques.

3)    Classement des chromosomes métaphasiques : le caryotype



1) Comment visualiser la chromatine ?

Il existe des colorants qui permettent de visualiser la chromatine grâce à leur affinité pour  l' ADN et/ou les protéines qui lui sont associées. Le plus couramment utilisé est le Giemsa qui est une association de trois colorants de base et qui donne une coloration rose violacée de la chromatine en lumière visible.

Il existe également des colorants fluorescents qui permettent de visualiser spécifiquement l'ADN car ils s'intercalent entre les bases de la double hélice. C'est le cas de la moutarde de quinacrine , du DAPI (4',6-diamino-2-phényl-indole)  ou de l'Iodure de Propidium _L.jpg .

Ces colorants fluorescents sont essentiellement employés dans le cadre de la cytogénétique moléculaire ( hybridation in situ de sondes d'ADN sur une préparation chromosomique) alors que le Giemsa est le colorant de base de toutes les techniques de marquage en bandes des chromosomes.


2) Obtention de préparations chromosomiques. haut de page

Comme on l'a vu plus haut, les chromosomes ne sont visibles que pendant une courte période du cycle cellulaire, lors de la division cellulaire ( mitose ou méiose ). Toutes les techniques cytogénétiques visent donc à obtenir un maximum de cellules bloquées à ce stade.


* 2.1) Culture cellulaire


Pour cela, il est nécessaire d'avoir des cellules en phase de multiplication active, soit spontanément (cas des villosités choriales ou de certaines cellules tumorales) soit par une culture préalable le plus souvent (fibroblastes, tout type cellulaire capable de se diviser) parfois associée à une stimulation (lymphocytes sanguins). La durée de cette culture est variable en fonction du type cellulaire considéré et de la quantité de matériel biologique disponible au départ.

Blocage des cellules en mitose

L'étape suivante consiste à bloquer les cellules en métaphase afin de pouvoir observer les chromosomes. Pour cela, on utilise un poison du fuseau de division (classiquement c'est la Colchicine qui est utilisée ou son équivalent synthétique la Colcémide) qui empèche la progression de la mitose vers l' anaphase .


* 2.2) Choc hypotonique


Les cellules sont alors plongées dans une solution hypotonique ce qui entraîne leur gonflement. Cette étape est indispensable à l'obtention d'un étalement correct des chromosomes.


* 2.3) Fixation - Etalement


Enfin, la dernière étape consiste en une fixation par un mélange d'alcool et d'acide acétique. La préparation est alors étalée en laissant tomber une goutte de la suspension cellulaire sur une lame.

Cas particulier : certains types cellulaires comme les fibroblastes adhèrent au support lors de la culture. On peut obtenir des métaphases à partir de ces cellules sans les détacher de leur support, toutes les étapes précédentes étant réalisées directement sur la surface de culture (sauf l'étalement qui est bien sûr inutile dans ce cas).


* 2.4) Coloration des préparations


Lorsque l'on colore des préparations chromosomiques avec du Giemsa, les chromosomes prennent un aspect rose violacé à peu près homogène sur toute leur longueur. On ne peut donc les distinguer les uns des autres que par leur taille et leur forme. Cependant, ces critères sont insuffisants pour assurer la reconnaissance et l'interprétation correcte des anomalies chromosomiques.

Pour reconnaître spécifiquement chaque paire chromosomique, on utilise donc des techniques de marquage particulières qui permettent d'obtenir une coloration inhomogène des chromosomes par le Giemsa et l'apparition de bandes. C'est la succession de bandes sombres et claires le long d'un chromosome, identique chez tous les individus pour un chromosome donné, qui en permet l'identification précise, selon le mème principe qu'un code à barres.

Il existe deux principales techniques de marquage en bandes des chromosomes ( banding ), utilisées en routine :

         les bandes G , obtenues après traitement des chromosomes par la trypsine

         les bandes R obtenues par un traitement à la chaleur .

Dans les deux cas, les bandes ne deviennent visibles qu'après une coloration avec le Giemsa. Ces deux techniques donnent un marquage réciproque, c'est-à-dire que là où l'on obtient une bande sombre avec l'une des deux techniques, on observe une bande claire avec l'autre _L.jpg .

D'autres techniques de marquage complémentaires existent qui permettent d'analyser certaines régions particulières du génome :

         Bandes C : cette coloration par le Sulfate de Baryium permet de mettre en évidence l' hétérochromatine constitutive, qui correspond à des régions non codantes du génome comme les régions centromériques.
         NOR : cette technique consiste en un dépôt de nitrate d'argent qui met en évidence les organisateurs nucléolaires. Ces structures correspondent aux régions du génome contenant les gènes qui codent pour les ribosomes . NOR_L.jpg


3) Classement des chromosomes métaphasiques : le caryotype  haut de page

Les chromosomes métaphasiques sont constitués d'un bras court (noté p ) et d'un bras long (noté q ), reliés entre eux par le centromère qui correspond à un étranglement situé à un niveau variable du chromosome et qui sert de point d'attache au fuseau de division pendant la division cellulaire.

 Plusieurs critères vont permettre de reconnaître et de classer les chromosomes :

         *la taille

Par convention, les chromosomes sont classés du plus grand au plus petit.

         *l'index centromérique, c'est-à-dire le rapport entre la taille du bras court et la taille totale du chromosome

Cet index permet de reconnaître trois familles de chromosomes :

         les chromosomes métacentriques dont les deux bras ont une taille à peu près équivalente

         les chromosomes submétacentriques qui ont un bras franchement plus petit que le bras long

         les chromosomes acrocentriques dont le bras court est quasi inexistant (on ne trouve sur ces bras courts que les gènes codant pour les ribosomes ; ces gènes étant présents à plusieurs centaines d'exemplaires double génome, la perte du bras court d'un chromosome acrocentrique n'a pas de conséquence clinique)

         *les bandes chromosomiques, qui sont caractéristiques de chacune des paires.

Le nombre de bandes visibles est variable d'une mitose à l'autre et dépend du niveau de condensation du chromosome. Plus les chromosomes sont condensés, moins on peut observer de bandes et moins l'analyse permet de dépister des anomalies de petite taille. Le nombre de bandes par lot haploïde (c'est-à-dire pour 23 chromosomes) permet de définir la résolution de l'analyse cytogénétique  ; un caryotype standard a une résolution de 300 à 550 bandes ; certaines techniques dites de haute résolution permettent d'augmenter le nombre de bandes visualisées en bloquant les chromosomes au tout début de leur condensation : on peut ainsi obtenir 800 ou même 1000 bandes par lot haploïde. Ces techniques de haute résolution sont de réalisation et d'interprétation plus délicates que le caryotype standard, mais permettent la mise en évidence d'anomalies de taille beaucoup plus réduite.



Notions de base en cytogénétique

  Qu'est ce qu'un chromosome ?

*   Les techniques d'étude (I) : le caryotype

*   Les techniques d'étude (II) : la cytogénétique moléculaire

*   L'interprétation du caryotype

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